Se encuentra en un enorme espacio abovedado, de 30 por 9 metros y casi 11 metros de altura. Está situada bajo el Patio de los Evangelistas, en la parte oriental del claustro, y recibe la luz del patio a través de cinco ventanas a ras de suelo. La pieza central es un precioso espejo con un marco barroco de plata con detalles de cristal de roca que fue un regalo de la reina Mariana de Austria (la madre de Carlos II), y hay otros seis espejos más pequeños que están convenientemente espaciados entre sí y tienen marcos de chapa de plata elaborados con maestría. El suelo es de mármol blanco y gris, y la bóveda está decorada con grotescos. Niccol Granello y Fabrizio Castello crearon los enormes artesonados con diversos adornos entre bandas en relieve.
Posee una excelente colección de obras de arte, que incluye piezas de Luca Giordano (Cristo crucificado), Tiziano (Cristo en la Oración del Huerto), José de Ribera (San Pedro en la Cárcel), Michel Coxcie (La Virgen, el Niño Jesús y Santa Ana ofreciéndole una pieza de fruta), Herrera Barnuevo y el falso profeta Balaan (San Juan Bautista) de Luca Giordano. Entre todos ellos destaca la Adoración de la Sagrada Forma, obra maestra del madrileño Claudio Coello. Representa la ceremonia religiosa celebrada el 19 de octubre de 1680 para el solemne traslado de la Sagrada Forma desde otra zona del Monasterio a su nueva Capilla en la sacristía. La composición es admirable tanto por la perspectiva como por la maestría de las figuras representadas: Carlos II, que aparece arrodillado, y el Padre Fray Marcos de Herrera,
La obra de Coello, que sirve de velo o transparencia al Santísimo Sacramento y sólo se retira una vez al año, cubre por completo el altar (el último domingo de septiembre). A continuación, se retira la pintura del suelo, dejando al descubierto el magnífico crucifijo, obra de Pietro Tacca, con la figura de Cristo exquisitamente modelada y fundida en bronce dorado al fuego, así como un templete de grandes dimensiones, también dorado al fuego, de estilo gótico-germánico, de 1,60 metros de altura y diseñado por Vicente López, que fue iniciado en 1829 por Ignacio Millán y terminado en 1834. Está adornada con cuarenta estatuillas y diez bustos y alberga numerosos objetos. Lamentablemente, una de las joyas desaparecidas en 1936 fue la costosísima custodia de Isabel II, regalo de la Reina en 1852, realizada en Madrid por Carlos Pizzala con un magnífico trabajo de orfebrería y engastada con valiosas piedras. Tras el retablo de mármol y bronce de la sacristía se encuentra el camarín, obra de Francisco Rizi, José del Olmo y Francisco Filippi.