La sinagoga fue construida entre los años 1355 y 1357, según las inscripciones que aparecen en el propio edificio. Fue realizada por orden de Samuel ha-Leví, miembro de la comunidad judía que, entre otros cargos, fue consejero y almojarife del Reino de Castilla durante el reinado de Pedro I de Castilla. La construcción se realizó pese a la existencia de la prohibición de erigir sinagogas, hecho que figura en Las Siete Partidas de Alfonso X, pero se incluía una provisión que permite a la Corona hacer excepciones a esta norma. Este fue el caso de la Sinagoga del Tránsito, cuya construcción fue permitida por Pedro I como agradecimiento por el apoyo y fidelidad de los judíos de la ciudad de Toledo al monarca en su lucha por la recuperación de la ciudad tras haber pasado a estar bajo control de Enrique de Trastámara.
En esta época la aljama de Toledo se convirtió en la más rica e influyente de Castilla y algunos judíos, de la misma manera que en época árabe, ocuparon cargos importantes dentro de la Corte. Castilla, y como máximo exponente dentro de ella la ciudad de Toledo, presentaba una religión dominante y dos minorías aceptadas (mudéjar y judía) siempre que no interfiriesen con el cristianismo. Además, se facilitaba la conversión de las religiones minoritarias al cristianismo, mientras que el caso contrario era castigado. La comunidad judía se encontraba presente en Toledo desde época romana y visigoda. En época árabe estaba situada en la Madinat al Yahud, en la parte sudoccidental de la urbe, y tenía un carácter semi independiente dentro de la propia ciudad. La aljama de la ciudad de Toledo contaba con su propia organización y tres áreas fundamentales: fiscal, jurisdiccional y religiosa. Aunque eran siervos del rey, poseían privilegios, teniendo los rabinos una amplia autoridad en aspectos de derecho privado y ritual.
La sinagoga era la institución fundamental judía en los principales núcleos urbanos de Castilla, después de su conquista a los musulmanes. En los fueros municipales eran entendidas como el "lugar donde los judíos podían reunirse para hacer sus juramentos", además de resolver litigios y pleitos. Esta interpretación hacía referencia a la presencia de una sinagoga comunitaria, pero esto no impedía la existencia de otras casas de oración más pequeñas para uso privado, establecidas a menudo por las familias más ricas.
A través de una serie de excavaciones realizadas a principios de 2000, se pudo determinar que bajo los cimientos de la sinagoga se dispondría de un complejo de baños, llamado Hamman de Zeit, que fue destruido para la edificación de la sinagoga entre 1357 y 1363. Además del terreno de la zona de baños, se derribaron las casas cercanas y sobre ese terreno se levantó la sinagoga, de autor desconocido, gracias al mecenazgo de Samuel ha-Leví. Junto a la Sinagoga se construiría la Mikve posiblemente también sufragada por Samuel ha-Leví.
Tras la expulsión de los judíos en 1492, la judería es ocupada por la nobleza y el área de la sinagoga es concedido por los Reyes Católicos a la Orden de Calatrava, que sitúa allí el priorato de San Benito y la convierte en iglesia privada de la Orden, construyendo al lado norte un archivo para las Órdenes militares de Calatrava y Alcántara.
En el siglo XVII la iglesia de San Benito pasa a ser conocida popularmente como "del Tránsito" debido al encargo que un caballero calatravo realiza al pintor de la escuela toledana Juan Correa de Vivar, de un cuadro del Tránsito de Nuestra Señora, que adornó el altar plateresco desde entonces.
Hasta el siglo XIX la iglesia sigue perteneciendo a las órdenes militares, apareciendo en la documentación como "ermita de San Benito", extramuros de la ciudad, muy abandonada y en continuo deterioro.La desamortización de 1835 apenas afecta al edificio pero si a los bienes muebles y en 1877 el rey, de conformidad con la Real Academia de Bellas Artes de San Fernando y a propuesta de la Dirección General de Instrucción Pública, declara la capilla del Tránsito como Monumento Nacional.
Posteriormente, en el año 1964, se decide que la Sinagoga Samuel ha-Leví sea la sede del museo sefardí, el cual tiene como objetivo conservar el legado de la cultura hispano-judía y sefardí para que quede integrada como parte esencial del Patrimonio Histórico Español, tarea que desempeña hasta la actualidad.