El interior de San Isidoro sorprende al visitante por su gran luminosidad, resultado de la abundancia de amplios ventanales en la nave central y en el crucero sur. Los paramentos, tanto rectos como curvos, se decoran con impostas de ajedrezado, un motivo que se repite de manera uniforme en todo el espacio, mientras que los capiteles destacan por su riqueza y número, ofreciendo un repertorio escultórico variado y detallado.

La Capilla Mayor, levantada en el siglo XVI y atribuida a Juan de Badajoz el Viejo, fue encargada por el padre Juan de Cusanza en 1513 para sustituir la antigua capilla románica de la infanta Urraca. En 1971 se realizaron trabajos de limpieza y restauración del suelo, que permitieron poner de nuevo a la vista los cimientos de la planta románica descubiertos por el arquitecto Torbado, señalizados mediante un dibujo sobre el pavimento. La capilla se cubre con una bóveda de crucería con terceletes, reflejo de la transición entre el gótico tardío y los gustos renacentistas de la época.

El retablo mayor, de factura gótica, procede de la parroquia de Pozuelo de la Orden (Valladolid) y fue trasladado a San Isidoro en 1920. Labrado entre 1525 y 1530, contó con la participación de un maestro llamado Giralte, posiblemente Giralte de Bruselas, y está compuesto por veinticuatro tablas de pintura atribuidas por Chandler R. Post a un Maestro de Pozuelo, identificado posteriormente con Lorenzo de Ávila, seguidor de Juan de Borgoña, junto con Antonio Vázquez y Andrés de Melgar, vinculados al círculo de Alonso Berruguete. La custodia, obra en plata de M. García Crespo, conserva la hostia consagrada expuesta día y noche por privilegio papal, compartido con la catedral de Lugo, y bajo ella se encuentra la urna neoclásica con los restos de San Isidoro, realizada en 1847 por el platero leonés Antonio Rebollo.

La capilla de la Trinidad, o de Santo Martino, fue construida hacia 1191 por el canónigo isidoriano Santo Martino detrás del ábside norte, con el fin de custodiar reliquias y servir como cementerio común de los canónigos. Originalmente pequeña, de planta rectangular y cabecera semicircular, y levantada con materiales humildes, se transformó en el siglo XVI al estilo hispano-flamenco y pasó a llamarse capilla de Santo Martino. El retablo, del siglo XVII y obra del tracista y ensamblador Pedro Margotedo, alberga la imagen del titular y la urna con los restos del santo.

El coro alto, situado a los pies de la iglesia, data de la primera mitad del siglo XV y pertenece al estilo gótico, construido durante el abadazgo de Simón Álvarez, cuyo escudo de armas puede observarse en una de las claves, integrándose así en la rica y variada decoración del templo.