Die Synagoge wurde zwischen 1355 und 1357 erbaut, wie aus den Inschriften am Gebäude selbst hervorgeht. Sie wurde im Auftrag von Samuel ha-Levi erbaut, einem Mitglied der jüdischen Gemeinde, der unter anderem Ratsherr und Almosenempfänger des Königreichs Kastilien während der Herrschaft von Pedro I. von Kastilien war. Der Bau wurde trotz des Verbots der Errichtung von Synagogen durchgeführt, das in den "Las Siete Partidas" von Alfons X. verankert ist, doch wurde eine Bestimmung aufgenommen, die es der Krone erlaubte, Ausnahmen von dieser Regel zu machen. Dies war der Fall bei der Synagoge von El Tránsito, deren Bau von Pedro I. als Dank für die Unterstützung und Loyalität der Juden der Stadt Toledo gegenüber dem Monarchen in seinem Kampf um die Rückgewinnung der Stadt, nachdem sie unter die Kontrolle von Enrique de Trastámara geraten war, genehmigt wurde.

Zu dieser Zeit wurde die Aljama von Toledo zur reichsten und einflussreichsten in Kastilien, und einige Juden bekleideten, wie in der arabischen Zeit, wichtige Positionen am Hof. In Kastilien und vor allem in der Stadt Toledo gab es eine vorherrschende Religion und zwei akzeptierte Minderheiten (Mudéjar und Juden), solange sie nicht mit dem Christentum kollidierten. Außerdem wurde der Übertritt von Minderheitsreligionen zum Christentum erleichtert, während das Gegenteil bestraft wurde. Die jüdische Gemeinde war seit der römischen und westgotischen Zeit in Toledo präsent. In der arabischen Zeit befand sie sich in Madinat al-Jahud, im südwestlichen Teil der Stadt, und hatte einen halb unabhängigen Charakter innerhalb der Stadt selbst. Die Aljama der Stadt Toledo hatte eine eigene Organisation und drei Hauptbereiche: Steuerrecht, Gerichtsbarkeit und Religion. Obwohl sie Diener des Königs waren, besaßen sie Privilegien, und die Rabbiner hatten weitreichende Befugnisse in Bezug auf Aspekte des privaten und rituellen Rechts.

Die Synagoge war die wichtigste jüdische Einrichtung in den wichtigsten städtischen Zentren Kastiliens nach der Eroberung durch die Muslime. In den städtischen Satzungen wurden sie als "Ort, an dem sich die Juden treffen konnten, um ihre Eide abzulegen", sowie zur Beilegung von Streitigkeiten und Rechtsstreitigkeiten verstanden. Diese Auslegung bezog sich auf das Vorhandensein einer Gemeindesynagoge, was jedoch nicht ausschloss, dass es auch kleinere Gebetshäuser für den privaten Gebrauch gab, die oft von wohlhabenderen Familien errichtet wurden.

Bei einer Reihe von Ausgrabungen Anfang der 2000er Jahre wurde festgestellt, dass sich unter den Fundamenten der Synagoge ein Badekomplex, der so genannte Hamman von Zeit, befunden haben muss, der für den Bau der Synagoge zwischen 1357 und 1363 zerstört wurde. Neben dem Badeplatz wurden auch die nahe gelegenen Häuser abgerissen, und an dieser Stelle wurde die Synagoge gebaut, deren Urheber unbekannt ist, dank der Schirmherrschaft von Samuel ha-Levi. Die Mikwe wurde neben der Synagoge gebaut, möglicherweise ebenfalls von Samuel ha-Levi finanziert.

Nach der Vertreibung der Juden im Jahr 1492 wurde das jüdische Viertel vom Adel besetzt, und das Areal der Synagoge wurde von den Katholischen Königen dem Calatrava-Orden überlassen, der dort das Priorat San Benito unterbrachte und es in eine Privatkirche des Ordens umwandelte, während an der Nordseite ein Archiv für die Militärorden von Calatrava und Alcántara errichtet wurde.

Im 17. Jahrhundert wurde die Kirche San Benito im Volksmund "del Tránsito" genannt, da ein Ritter aus Calatrava bei dem Maler Juan Correa de Vivar aus der Schule von Toledo ein Gemälde des Transitus der Madonna in Auftrag gegeben hatte, das seit dieser Zeit den plateresken Altar schmückt.

Bis zum 19. Jahrhundert gehörte die Kirche weiterhin den Militärorden und erscheint in den Unterlagen als "Einsiedelei von San Benito", außerhalb der Stadtmauern, sehr verlassen und in ständigem Verfall begriffen. Die Beschlagnahmung von 1835 betraf kaum das Gebäude, wohl aber das bewegliche Eigentum, und 1877 erklärte der König im Einvernehmen mit der Königlichen Akademie der Schönen Künste von San Fernando und auf Vorschlag der Generaldirektion für das öffentliche Unterrichtswesen die Kapelle von El Tránsito zum Nationaldenkmal.

Später, im Jahr 1964, wurde beschlossen, dass die Samuel ha-Levi-Synagoge der Sitz des Sephardischen Museums werden sollte, dessen Ziel es war, das Erbe der spanisch-jüdischen und sephardischen Kultur zu bewahren, um es als wesentlichen Teil des historischen Erbes Spaniens zu integrieren, eine Aufgabe, die es bis heute erfüllt.