Le Colisée a subi d'importantes transformations dans son utilisation à l'époque médiévale. À la fin du VIe siècle, une modeste église a été érigée à l'intérieur de la structure de l'amphithéâtre, bien que cet ajout ne semble pas avoir donné une signification religieuse à l'ensemble du bâtiment. Entre-temps, l'arène a été transformée en cimetière, et les larges espaces entre les arches et sous les sièges ont trouvé une nouvelle utilité en tant qu'ateliers et abris. Selon les archives historiques, ces espaces ont même été loués jusqu'au 12e siècle.

Sous le pontificat de Grégoire le Grand, de nombreux monuments anciens passèrent sous la tutelle de l'Église, qui détenait alors l'autorité prédominante. Cependant, faute de moyens, l'Église n'est pas en mesure de les entretenir correctement et, par conséquent, ces monuments tombent en désuétude et font l'objet de pillages. Au Moyen Âge, le déclin de la ville touche tous les vestiges de l'Empire romain. Les tremblements de terre de 801 et 847 ont gravement endommagé un bâtiment pratiquement abandonné à la périphérie de la ville médiévale.

En 1084, lorsque le pape Grégoire VII fut banni de Rome, plusieurs monuments passèrent aux mains des familles nobles influentes de la ville, qui les utilisèrent comme fortifications. Vers 1200, la famille Frangipani prit possession du Colisée et le fortifia, le traitant comme un château et établissant sa domination sur lui. Le Colisée changea plusieurs fois de propriétaire jusqu'à ce qu'il soit rendu à l'Église en 1312.

Le tremblement de terre dévastateur de 1349 a infligé des dommages considérables à la structure du Colisée, entraînant l'effondrement du côté sud de sa façade extérieure. De nombreuses pierres détachées ont été récupérées et utilisées pour la construction de palais, d'églises (y compris dans la Cité du Vatican), d'hôpitaux et d'autres bâtiments dans toute la ville de Rome. Un ordre religieux s'est installé dans la partie nord du Colisée et y a vécu jusqu'au début du 19e siècle. La pierre à l'intérieur de l'amphithéâtre a été fortement extraite, soit pour être réutilisée ailleurs, soit, dans le cas des façades en marbre, pour produire de la chaux vive par combustion. Les consoles en bronze qui maintenaient la maçonnerie en place ont été retirées des murs, laissant de nombreuses traces. Ces cicatrices sont encore visibles aujourd'hui dans la structure du bâtiment.