La synagogue a été construite entre 1355 et 1357, selon les inscriptions sur le bâtiment lui-même. Il a été construit sur ordre de Samuel ha-Levi, un membre de la communauté juive qui, entre autres fonctions, a été conseiller et almojarife du Royaume de Castille sous le règne de Pierre Ier de Castille. La construction a été réalisée malgré l'existence d'une interdiction d'ériger des synagogues, un fait qui apparaît dans Las Siete Partidas d'Alfonso X, mais une disposition a été incluse permettant à la Couronne de faire des exceptions à cette règle. C'est le cas de la synagogue de El Tránsito, dont la construction a été autorisée par Pedro Ier en remerciement du soutien et de la loyauté des Juifs de la ville de Tolède envers le monarque dans sa lutte pour la récupération de la ville après qu'elle soit passée sous le contrôle d'Enrique de Trastámara.

À cette époque, l'aljama de Tolède devient le plus riche et le plus influent de Castille et certains Juifs, comme à l'époque arabe, occupent des postes importants à la Cour. La Castille, et la ville de Tolède qui en était le plus grand représentant, avait une religion dominante et deux minorités acceptées (mudéjar et juive) tant qu'elles n'interféraient pas avec le christianisme. En outre, la conversion des religions minoritaires au christianisme a été facilitée, tandis que le contraire a été puni. La communauté juive était présente à Tolède depuis l'époque romaine et wisigothique. Pendant la période arabe, il était situé à Madinat al-Jahud, dans la partie sud-ouest de la ville, et avait un caractère semi-indépendant au sein de la ville elle-même. L'aljama de la ville de Tolède avait sa propre organisation et trois domaines fondamentaux : fiscal, juridictionnel et religieux. Bien qu'ils soient des serviteurs du roi, ils possédaient des privilèges, et les rabbins avaient une large autorité sur les aspects du droit privé et rituel.

La synagogue était l'institution juive fondamentale dans les principaux centres urbains de Castille après sa conquête sur les musulmans. Dans les chartes municipales, elles étaient comprises comme le "lieu où les Juifs pouvaient se réunir pour prêter serment", en plus de régler les litiges et les procès. Cette interprétation faisait référence à la présence d'une synagogue communautaire, mais cela n'excluait pas l'existence de plus petites maisons de prière à usage privé, souvent établies par des familles plus aisées.

Grâce à une série de fouilles menées au début des années 2000, il a été déterminé que sous les fondations de la synagogue se trouvait un complexe de bains, appelé le Hamman de Zeit, qui a été détruit pour la construction de la synagogue entre 1357 et 1363. Outre l'emplacement de la zone de baignade, les maisons voisines ont été démolies et la synagogue a été construite sur ce site, dont l'auteur est inconnu, grâce au mécénat de Samuel ha-Levi. Le Mikveh a été construit à côté de la synagogue, probablement aussi financé par Samuel ha-Levi.

Après l'expulsion des Juifs en 1492, le quartier juif a été occupé par la noblesse et la zone de la synagogue a été concédée par les Rois Catholiques à l'Ordre de Calatrava, qui y a placé le prieuré de San Benito et l'a converti en église privée de l'Ordre, en construisant des archives sur le côté nord pour les Ordres militaires de Calatrava et Alcántara.

Au XVIIe siècle, l'église de San Benito est devenue populairement connue sous le nom de "del Tránsito" en raison de la commande d'un chevalier calatravan au peintre Juan Correa de Vivar de l'école de Tolède d'un tableau représentant le Transitus de la Vierge, qui a orné l'autel plateresque à partir de cette époque.

Jusqu'au XIXe siècle, l'église a continué d'appartenir aux ordres militaires, apparaissant dans la documentation comme "l'ermitage de San Benito", hors des murs de la ville, très abandonné et en continuelle détérioration. La confiscation de 1835 n'a guère affecté le bâtiment mais a touché les biens mobiliers et en 1877, le roi, en accord avec l'Académie royale des beaux-arts de San Fernando et sur proposition de la Direction générale de l'instruction publique, a déclaré la chapelle de El Tránsito monument national.

Par la suite, en 1964, il a été décidé que la synagogue Samuel ha-Levi serait le siège du musée sépharade, dont l'objectif était de conserver l'héritage de la culture juive espagnole et sépharade afin de l'intégrer comme une partie essentielle du patrimoine historique espagnol, une tâche qu'il a accomplie jusqu'à aujourd'hui.