Tout le tiers sud de la structure est occupé par le monastère. Bien que les pères augustins cloîtrés y vivent depuis 1885, les moines hiéronymites y ont habité pour la première fois en 1567. L'une des représentations remarquables de l'architecture du monastère, le Patio de los Evangelistas, chef-d'œuvre créé par Juan Bautista de Toledo, sert de point focal à l'enceinte. Le magnifique escalier principal qui relie ses deux étages présente des fresques de Luca Giordano sur ses voûtes. Luca Cambiaso et Pellegrino Tibaldi ont poursuivi l'ambitieux concept graphique de Luca Cambiaso pour ses colonnades. Juan de Herrera, qui s'est inspiré du Tempietto de San Pietro in Montorio de Bramante, a créé un temple étonnant au centre du cloître en granit, marbre et jaspe dans une variété de couleurs. Juan Bautista Monegro a ciselé les sculptures des quatre évangélistes dans un seul bloc de marbre, et chacun tient un livre ouvert avec un passage de son évangile imprimé dans la langue dans laquelle il a été écrit à l'origine.

La cellule du prieuré inférieur, qui est distincte des salles capitulaires voisines, présente une peinture au plafond représentant le Jugement de Salomon de Francesco da Urbino, qui rappelle au prieur la nécessité d'avoir une administration juste à la tête du monastère. L'Adoration de la forme sacrée de Claudio Coello se trouve dans la sacristie, qui est toujours utilisée. Le Martyre de saint Laurent du Titien, l'une des grandes œuvres de la Renaissance italienne, est conservé dans l'église ancienne ou empruntée. Philippe II l'avait fait peindre pour le retable principal de la basilique, mais a décidé de ne pas le faire à cause de sa couleur sombre, qui le rendait difficile à voir de loin.