Au cours des XVIe et XVIIe siècles, l'université d'Alcalá s'est imposée comme l'un des centres universitaires les plus prestigieux du monde hispanique. Elle est devenue un foyer de savoir et de pensée critique, en particulier dans les domaines de la théologie, de la philosophie, du droit, des langues classiques et de la médecine. Son imprimerie, la célèbre Typographia Complutense, s'est illustrée par l'édition de la Biblia Políglota Complutense, une œuvre monumentale coordonnée par Cisneros lui-même.

En 1777, dans le cadre des réformes des Lumières du règne de Charles III, l'université a été institutionnellement séparée de son emblématique Colegio Mayor et rebaptisée Université royale d'Alcalá. Cette nouvelle phase l'installe dans le bâtiment précédemment occupé par le Colegio Máximo de los Jesuitas, également à Alcalá. Cependant, l'institution a connu un lent déclin en raison des changements politiques, sociaux et économiques qui ont affecté l'Espagne à la fin du XVIIIe siècle et au début du XIXe siècle.

Finalement, en 1836, l'université a été transférée à Madrid, dans le cadre d'un processus de centralisation du système éducatif promu par l'État libéral. Elle fusionne avec les Reales Estudios de San Isidro et le Real Museo de Ciencias Naturales pour former l'Universidad Central de Madrid, à l'origine de l'actuelle Universidad Complutense de Madrid, héritière directe de la tradition cisnérienne.

Tout au long de son histoire, l'université d'Alcalá a été le berceau et le foyer de nombreuses personnalités de la pensée, de la littérature et de la science. Parmi ses professeurs et étudiants les plus célèbres, citons Antonio de Nebrija, auteur de la première grammaire de la langue castillane, Saint Thomas de Villanueva, l'historien Juan Ginés de Sepúlveda, Saint Ignace de Loyola, fondateur de la Compagnie de Jésus, le théologien Domingo de Soto, le chroniqueur Ambrosio de Morales, Benito Arias Montano, éditeur de la Biblia Regia, le philosophe jésuite Francisco Suárez, l'historien et jésuite Juan de Soto, l'auteur de la première édition de l'Encyclopédie de l'Université d'Alcalá, l'auteur de la première édition de l'Encyclopédie de l'Université d'Alcalá ; le jésuite et historien Juan de Mariana ; le médecin Francisco Vallés de Covarrubias ; l'homme politique Antonio Pérez ; des mystiques comme San Juan de la Cruz ; des écrivains de l'envergure de Mateo Alemán, Lope de Vega, Francisco de Quevedo et Pedro Calderón de la Barca ; l'illuminé Melchor Gaspar de Jovellanos ; le scientifique Andrés Manuel del Río, découvreur du vanadium ; et le religieux Fray Diego Morcillo, parmi beaucoup d'autres.