Das gesamte südliche Drittel des Gebäudes wird von dem Kloster eingenommen. Obwohl die Augustiner-Klausurpatres seit 1885 dort leben, wurde es 1567 von Hieronymitenmönchen bewohnt. Der Patio de los Evangelistas, ein Meisterwerk von Juan Bautista de Toledo, ist eines der herausragenden Zeugnisse der Architektur des Klosters und bildet den Mittelpunkt der Anlage. Die prächtige Haupttreppe, die die beiden Stockwerke miteinander verbindet, weist in den Gewölben Fresken von Luca Giordano auf. Luca Cambiaso und Pellegrino Tibaldi setzten das ehrgeizige grafische Konzept von Luca Cambiaso für die Kolonnaden fort. Juan de Herrera, der sich von Bramantes Tempietto von San Pietro in Montorio inspirieren ließ, schuf im Zentrum des Kreuzgangs einen beeindruckenden Tempel aus Granit, Marmor und Jaspis in verschiedenen Farben. Juan Bautista Monegro meißelte die Skulpturen der vier Evangelisten aus einem einzigen Marmorblock. Sie halten jeweils ein aufgeschlagenes Buch, in dem ein Abschnitt aus ihrem Evangelium in der Sprache abgedruckt ist, in der es ursprünglich geschrieben wurde.

In der unteren Zelle des Priorats, die sich von den daneben liegenden Kapitelsälen unterscheidet, befindet sich an der Decke das Gemälde Das Urteil des Salomo von Francesco da Urbino, das den Prior an die Notwendigkeit einer gerechten Verwaltung des Klosters erinnern soll. Die Anbetung der Heiligen Gestalt von Claudio Coello befindet sich in der Sakristei, die noch immer in Gebrauch ist. Das Martyrium des heiligen Laurentius von Tizian, eines der großen Werke der italienischen Renaissance, wird in der Alten oder geliehenen Kirche aufbewahrt. Philipp II. ließ es für das Hauptaltarbild der Basilika malen, entschied sich aber wegen der dunklen Farbe, die es aus der Ferne schwer zu erkennen machte, dagegen.