Philipp II. schenkte der Klosterbibliothek nicht nur die umfangreichen Kodizes, die er besaß, sondern ordnete auch den Kauf der besten Bücher und Bibliotheken aus dem In- und Ausland an. Juan de Herrera schuf sie, und Juan Bautista de Toledo stellte sie in den verschwundenen Mittelturm der Südfassade, der das Atrium der Basilika umschließt und die Hauptfassade einbezieht. Die darin befindlichen Regale wurden ebenfalls von Herrera entworfen. Es befindet sich in einem großen Kirchenschiff, das 54 m lang, 9 m breit und 10 m hoch ist. Der Marmorfußboden und die Regale sind aus kunstvoll geschnitztem Holz gefertigt.

Für seinen ersten Katalog wählte Arias Montano einige der bedeutendsten Stücke aus. Die Sammlung umfasst mehr als 40.000 außerordentlich wertvolle Titel. Es erhielt 1616 das Recht, ein Exemplar jedes in Spanien gedruckten Buches zu erhalten, auch wenn dieses Privileg nie vollständig realisiert wurde.

Die Fresken der sieben freien Künste - Rhetorik, Dialektik, Musik, Grammatik, Arithmetik, Geometrie und Astrologie - schmücken die Decke des Tonnengewölbes der Bibliothek. Unter den Bücherregalen befanden sich Porträts mehrerer spanischer Könige, darunter der bekannte Silberne Philipp (Philipp IV. in einem kastanienbraunen und silbernen Anzug), ein Gemälde von Velázquez, das heute in der National Gallery in London zu sehen ist. Laut dem ikonologischen Programm von Pater Sigüenza hat Pellegrino Tibaldi die Fresken in den Gewölben gemalt.

Die Entscheidung Philipps II., seine Bibliothek den Mönchen des Klosters zu schenken, um ein Zentrum der Weisheit zu errichten, anstatt sie auf seine anderen Paläste wie Aranjuez, Valsan oder den Alcázar von Madrid aufzuteilen und sie somit nur seinen Erben zu schenken, muss durch den Ruf Salomos als weiser König par excellence der Bibel beeinflusst worden sein.