Im 16. und 17. Jahrhundert etablierte sich die Universität von Alcalá als eines der angesehensten akademischen Zentren der hispanischen Welt. Sie wurde zu einem Zentrum des Wissens und des kritischen Denkens, insbesondere in den Bereichen Theologie, Philosophie, Recht, klassische Sprachen und Medizin. Ihre Druckerei, die berühmte Typographia Complutense, wurde durch die Ausgabe der Biblia Políglota Complutense bekannt, ein monumentales Werk, das von Cisneros selbst koordiniert wurde.

Im Jahr 1777 wurde die Universität im Zuge der Aufklärungsreformen unter Karl III. institutionell von ihrem emblematischen Colegio Mayor getrennt und in Königliche Universität von Alcalá umbenannt. In dieser neuen Phase befand sie sich in dem Gebäude, das zuvor vom Colegio Máximo de los Jesuitas, ebenfalls in Alcalá, genutzt wurde. Aufgrund der politischen, sozialen und wirtschaftlichen Veränderungen im Spanien des späten 18. und frühen 19. Jahrhunderts erlebte die Institution jedoch einen langsamen Niedergang.

Schließlich wurde die Universität 1836 im Zuge der vom liberalen Staat vorangetriebenen Zentralisierung des Bildungssystems nach Madrid verlegt. Sie fusionierte mit den Reales Estudios de San Isidro und dem Real Museo de Ciencias Naturales zur Universidad Central de Madrid, der Keimzelle der heutigen Universidad Complutense de Madrid, einer direkten Nachfolgerin der Cisnerianischen Tradition.

Im Laufe ihrer Geschichte war die Universität von Alcalá die Wiege und Heimat zahlreicher Persönlichkeiten des Denkens, der Literatur und der Wissenschaft. Zu ihren berühmtesten Professoren und Studenten gehören Antonio de Nebrija, Autor der ersten Grammatik der kastilischen Sprache, der heilige Thomas von Villanueva, der Historiker Juan Ginés de Sepúlveda, der heilige Ignatius von Loyola, Gründer der Gesellschaft Jesu, der Theologe Domingo de Soto, der Chronist Ambrosio de Morales, Benito Arias Montano, Herausgeber der Biblia Regia, der Jesuitenphilosoph Francisco Suárez; der Jesuit und Historiker Juan de Mariana, der Arzt Francisco Vallés de Covarrubias, der Politiker Antonio Pérez, Mystiker wie San Juan de la Cruz, Schriftsteller wie Mateo Alemán, Lope de Vega, Francisco de Quevedo und Pedro Calderón de la Barca, der aufgeklärte Melchor Gaspar de Jovellanos, der Wissenschaftler Andrés Manuel del Río, Entdecker des Vanadiums, und der Ordensmann Fray Diego Morcillo und viele andere.